核酸如何检测9篇核酸如何检测 新型冠状病毒实验室核酸检测及结果处置流程 核酸检测实验室核心控制目标21控制病原污染，保证生物安全。控制病原体感染操作人员，污染样本及下面是小编为大家整理的核酸如何检测9篇,供大家参考。
篇一：核酸如何检测
冠状病毒实验室核酸检测及结果处置流程核酸检测实验室核心控制目标21 控制病原污染，保证生物安全。控制病原体感染操作人员，污染样本及环境控制核酸污染 ，保证结果正确。控制核酸污染试剂、样本、环境及设备严格规范新冠核酸检测工作流程，加强生物安全意识。
新型冠状病毒核酸检测实验室要求 实验室建设：按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法（卫办医政发【2010】194号）有关规定 实验室检测：按照《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行 第二版）（联防联控机制医疗发【2020】）313号
实验室建设与使用规 范原则上设4 4个区域，各区域在物理空间上必须是 完全相互独立，无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全分隔状态， 不能有空气的直接相通。试剂准备间核酸扩增间产物分析间核酸提取 间缓冲 间 缓冲 间 缓冲 间缓冲 间
核对信息标本签收：运送人员和接收人员双签收开始检测消毒并重新采样收样室 试剂配制间试剂盒开封后立即取出阳性对照和阴性对照放置核酸提取间所有试剂充分解冻，混匀离心后分装• 样本盖子拧紧• 充分震荡、离心标本加样提取核酸核酸加样加样枪切勿插进管内加阴性对照和室内弱阳性质控品• 先加样本核酸和试剂阴性对照• 封膜或盖管• 最后加阳性对照• 消毒实验台面和仪器表面实验结束 • 更换手套后处理 • 医疗废物即清核酸提取间 核酸扩增间• 核对扩增程序• 确保反应板或管密封• 离心、上机结果判定严格按照试剂盒说明书• 扩增结束后，严禁开盖• 及时清理反应板，按一般医疗废弃物处理核酸检测结果处置阴性连同原阳性样本上送市疾控重点人群样本-20℃保存7天无泄漏泄漏新冠病毒核酸检测及结果处置流程注意: 实验室严格分区 ， 实验服及物品专区专用 ， 切勿混用 。阴性重新采样：鼻咽拭子、咽拭子+血液样本双靶标、单靶标阳性或灰区个人防护：按照采样人员防护装备执行检查样本是否泄漏生物安全: •人员防护按照三级防护水平• 在生物安全二级实验室开展，双人操作• 吸取样本在安全柜内操作• 核酸加样在安全柜内操作• 离开安全柜更换手套个人防护：着本区实验服样本高压灭菌消毒处理个人防护：着本区实验服双试剂盒平行试验 血清抗体检测阳性 阴性• 延长医学观察期限• 增加核酸与抗体检测频次• 样本保存同上重新采样：鼻咽拭子、咽拭子+血液样本样本一式两份，一份用于本级疾控中心检测，另一份连同原阳性样本上送省疾控同步进行复检
采样人员防护装备 ：• N95及以上防护口罩• 护目镜• 防护服、乳胶手套、防水靴套• 每采一个人应当进行严格手消毒或更换手套1收 样 标本接收人员的个人防护：按采样人员防护装备执行 样本双签收 ：标本运送人员+接收人员！
注意检查标本是否泄 漏若有泄漏 ， 及时进行消毒处理并重新采 样 标本应尽快送实验室检测，标本转运箱使用前后及时作消毒处理； 临时保存须有专人负责，专柜保管，双人双锁，同时准确记录样本来源、数量等必要信息。
所有试剂充分解冻，混匀离心后分装个人防护（本区域专用实验服）试剂盒开封立即取出阳性对照和阴性对照放置核酸提取间（如传递窗）2试剂配制间
吸取标本核酸加样实验结束后处理：• 消毒实验台面和仪器表面• 更换手套• 医疗废物即清加样枪切勿 插进管 内加阴性对照和 室内 阳性质控 品• 先加样本核酸 和试剂阴性对 照• 封膜或盖 管• 最后加阳性对 照提取核酸• 样本盖子拧紧• 充分震荡、离心3核酸提取 （ 二级生物安全实验室）
加样间生物安全: :• 人员防护按照三级防护水平• 在生物安全二级实验室开展，双人操作• 吸取样本在安全柜内操作• 核酸加样在安全柜内操作• 离开安全柜更换手套注意 ！健康筛查的样本和疑似病例样本不可同批检测，须分批检测
个人防护：本区域专用实验服核对扩增程序确保反应板或管密封离心、上机结果判定严格按照试剂盒说明书进行扩增结束后，严禁开盖及时清理反应板，按一般医疗废弃物处理4核酸扩增间
鼻咽拭子、咽拭子和血液样本双份（1份送市疾控、另1份备送省疾控）双靶标 、 单靶标阳性或灰 区复检采用另外1-2种不同厂家的试剂盒阳性重点人群样本-20℃ 以下保存7天样本高压灭菌消毒处理市疾控中心阴性5核酸检测结果处置
市疾控中 心血清抗体检测阳 性阳性+重采样本不同厂家的两个试剂盒平行试验（手工提核酸）阴性 阴性阳性样本+备份重采样本上送 省疾控中 心• 延长医学观察期限• 增加抗体检测频次• 重点人群样本-20℃保存7天• 高压灭菌消毒处理阳 性• 延长医学观察期限• 增加核酸检测频次• 重点人群样本-20℃保存7天• 高压灭菌消毒处理可疑阳 性结果报 告报告要求 ：
以县区为单位，冬春季 本地感染病例或核酸阳性者，第一时间报告 省卫 生健康委和省疾控中心——《广东省新冠肺炎防控指挥办疫情防控组关于印发广东省新冠肺炎本地疫情应急处置方案（试行）的通知》（粤卫应急函〔2020〕136号5核酸检测结果处置
报告要求 ：
以县区为单位，冬春季 本地感染病例或核酸阳性者，第一时间报告省卫生健康委和省疾控中心——《广东省新冠肺炎防控指挥办疫情防控组关于印发广东省新冠肺炎本地疫情应急处置方案（试行）的通知》（粤卫应急函〔2020〕136号 对于发热门诊、急诊患者：6小时内报告 普通门诊、住院患者及陪护人员等人群：12小时内报告 “愿检尽检”人群：24小时内报告报告依据——《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行 第二版）(联防联控机制医疗发【2020】)313号6 医院核酸检测结果报告时限要求
新型冠状病毒样本安全管理、规范运输、销毁及废弃物处置1. .样本管理 （鼻咽拭子、支气管灌洗液、肛拭子和血液等生物样本）接收的样本须有专人负责专柜保管，双人双锁，建立台账并且准确记录样本的来源、数量等必要信息。2. .样本的销毁在相应的生物安全防护水平实验室、采用安全可靠的方法、双人共同操作，对销毁过程进行严格监督。完成后有处置的书面记录存档。3..实验室废弃物处理• 开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定医疗废物处置程序及污物、污水处理操作程序；• 所有的危险性医疗废物必须按照统一规格化的容器和标示方式，完整且合规地标示废物内容；• 由经过适当培训的人员使用适当的个人防护装备和设备处理危险性医疗废物；• 建立医疗废物处理记录，定期对实验室排风及HEPA过滤器的更换。4..阳性样本的上送运输上送阳性样本必须严格按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》进行。市内运输由各市卫生健康行政部门管理，跨地级市运输由各市卫生健康行政部门初审后报广东省委审批。
THA A NKS S
篇二：核酸如何检测
2 新冠肺炎病毒核酸检测流程图出现新冠肺炎局部疫情暴发各县（市）区指挥部立即报市指挥部 各县（市）区指挥部迅速采取行动：（1）划定封闭区域；（2）开展流行病学调查；（3）按网格化原则划定核酸检测人群范围；（4）开展核酸检测宣传动员和组织工作。迅速布置核酸检测采样点，做好公告和标识 核酸检测采样人员到位开展采样工作 样本由专人、专车转运至检测机构 检测机构迅速对样本进行检测 检测机构 24 小时内报告结果并反馈各县（市）区指挥部 各县（市）区指挥部将检测人群的检测结果立即报市指挥部 检测阳性人员由各县（市）区指挥部送市级定点医院进行集中医学观察
篇三：核酸如何检测
冠状病毒感染 疑似或 确诊患者核酸检测标本 采集 、 送检、 处理 流程
需做新型冠状病毒核酸检测 主管医生开具医嘱；检验科领取专用采集管和转运箱；通知检验科陈月华（6416）
放入内层小密封袋封口，75%酒精消毒外侧；放入外层大密封袋封口，75%酒精消毒外侧（双层密封袋开口均向上）；垂直放于专用转运箱（转运箱密封良好有 XS 标识，不进入隔离病房），75%酒精喷雾消毒后封箱 医生采集标本（采集者三级生物安全防护）
标本转运 核对、交接、登记，专人单独转运至检验科双开门通道，交给 PCR 实验室人员 （转运人员需三级生物安全防护；转运期间保持平稳、勿震荡、勿开箱；如发生意外，到达接收地点，说明情况，共同处理）
标本接收PCR 人员确认转运箱，生物安全柜内打开转运箱（开箱瞬间 75%酒精喷雾消毒）
核对标本登记（实验室人员需三级生物安全防护）
从转运箱取出标本，56℃ 30 分钟灭活，采样管降至常温后，生物安全柜内开盖检测 实验完成后，向科主任报告检测结果，科主任报告医院领导及医务科
有效氯含量 1000mg/L 的消毒剂擦标本转运箱，消毒后的转运箱交给下一批送标本人员带回；有效氯含量 1000mg/L 的消毒剂擦拭台面、地面。
上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子各 1 根，一起放至于同一根核酸标本保存管，旋转拧紧标本管盖子，75%酒精消毒标本容器表面下呼吸道标本：深咳痰液、或呼吸道吸取物、或支气管/肺泡灌洗液（专用大螺旋管）旋转拧紧标本管盖子，75%酒精消毒标本容器表面 标本采集使用后的标本密封袋封口后放至双层黄色垃圾袋（袋内含有效氯含量 1000mg/L 的消毒剂），封口，袋外 75%酒精喷雾消毒，移出安全柜高压灭菌，按照感染性医疗废弃物处理 操作完成后：75%酒精喷洒生物安全柜消毒，开启紫外灯照射 30 分钟；所有房间开启紫外灯照射 30 分钟
篇四：核酸如何检测
型冠状病毒核酸检验流程记录表试剂准备区I (I 区) )
操作者：
时间：2022-
试验批号 2019-nCoV-
.
1. 实验前
□消毒：75%酒精擦拭或喷洒工作台面、移液器、离心机、混匀器等；□准备：EP 管、枪头、75%酒精、8 联管及盖子；□冰箱温度：冷冻室(-20℃)、冷藏室(2～8℃)；□实验室：温度(20～28℃)、相对湿度(30～70%)。
2. 配置使用试剂
2.1扩增试剂
□达安基因新冠核酸检测试剂；□硕世新冠核酸检测试剂；□明德新冠核酸检测试剂；□
； 检测样本数：
，试剂批号：
有效期：
；
□从-20℃冰箱取出试剂，室温融化后震荡混匀，离心数秒后使用； 需配置总量：N=(样本数+2 个弱阳性质控+3 个阴性质控)，按新冠病毒核酸检测试剂用量配制表配制 PCR 总反应液，并充分混匀； □分装：8 联管每管加 20μl 反应液（达安、硕士、明德），放入自封袋内封闭，移至传递窗内； □分装：8 联管每管加 30μl 反应液（圣湘），放入自封袋内封闭，移至传递窗内； 2.2提取试剂 □
核酸提取及纯化试剂
人/份； 数量
盒，试剂批号
，有效期：
； 2.3仪器设备使用 离心机：□正常□不正常、振荡器：□正常□不正常、超净台：□正常□不正常； 3. 实验后
□消毒：75%酒精擦拭台面，移液器、离心机、混匀器等，紫外照射至少60min； □整理和统计实验器材和耗材； □废弃物处理并打包。
新型冠状病毒核酸检验流程记录表
样本制备区( (I II 区) )
操作者：
时间：2022-
试验批号：2019-nCoV-
.
1. 实验前
1.1实验前准备 □耗材：EP 管、移液枪、带滤芯检头、75%酒精、含氯消毒剂； □消毒：开启生物安全柜并紫外照射 30min 后，75%酒精擦拭台面； □样本转运箱表面用 75%酒精消毒，在生物安全柜内打开转运箱，75%酒精消毒后拿出标本； □核对标本总数后，检查样本编号、密封性及拭子和样本液的有无异常，如有，立即联系； 2. 核酸(RNA) 提取与加样 开启□达安-Ⅰ、□达安-Ⅱ、□康为-Ⅰ、□
、□
核酸提取仪，按核酸提取仪操作程序操作。
3. 试验后 3.1消毒 □己测样本、利器盒分别放入医疗垃圾袋内封口，喷洒 75%酒精，拿出安全柜； □生物安全柜喷洒 75%酒精，擦拭干净；生物安全柜紫外消毒至少 60min； □垃圾袋打包，喷洒含氯消毒液并带出至消洗间、地面喷洒含氯消毒液消毒； □开启提取仪紫外消毒灯、移动紫外灯、传递窗紫外消毒灯,至少 60min； □防护服喷洒含氯消毒剂(两人协助)后；更换外层手套； 3.2 样本：将原始样本及提取核酸暂存，直至检测结果分析完毕，放入垃圾袋内带出；
新冠状病毒核酸检验流程记录表
扩增检测区( ( III
区) )
操作者：
时间：2022-
保存文件名
.
1. 程序运行 1.1实验室：□温度(20～28℃)；□相对湿度(30～70%)； 1.2先开启电脑，再启动仪器，预热 10～15min； 1.3选择对应的仪器及程序，运行仪器：
□宏石-Ⅰ、□宏石-Ⅱ、□宏石-Ⅲ、□宏石-Ⅳ、□天隆-Ⅰ、□天隆-Ⅱ、 □ABI-QS5、□安杰思 8830-16 1.4文件命名：时间-编号，并保存结果至文件夹； 2. 结果分析 2.1 根据分析后图像判断是否需微调基线和阈值，如无异常，可取仪器默认数据，点击分析自动获得分析结果，进行判读,并将结果填入下表
2.2质控是否在控 阳性质控 1（CT：
）、□阳性质控 2（CT：
）、□阴性质控-1（CT：
）、□阴性质控-2（CT：
）、□内标； 3. 复检 如结果异常，按新型冠状病毒核酸检测复检规则及流程进行复检，并记录； 4. 实验后 □检测结果分析完毕，立即将 PCR 反应管密封于密封袋内，放入垃圾袋中； □消毒：台面 75%酒精喷洒，传递窗紫外消毒，房间紫外灯消毒至少 60min； 5. 实验室整体消毒 □所有实验完成后，开启整体实验室紫外消毒灯定时器，消毒至少 60min。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A
B
C
D
E
F
G
H
篇五：核酸如何检测
检测 步骤据《成都发布》2021 年 11 月 10 日消息：核酸结果出得太慢？看似只需要几秒钟的核酸采样之后，还需要哪些步骤？成都医学院第一附属医院医务部部长刘刚，为我们做详细解释：
第一 、 采样前准备工作
需要持本人身份证件排队进行信息录入、查验健康码、缴费、打印条码、粘贴采集管等前期准备流程，做好准备后就正式开始重要的七步程序。
第二 、 采样检验
1. 标本采集
这一步，也是市民能亲身“参与”到的步骤，采样人员将采集的咽拭子标本立即、迅速放进样本保存管中，保存管里的保存液同时具有灭活病毒的作用。
刘刚解释说 ：需要注意的是，一般采样点都在开阔、通风位置，而检测室则需要在非人员密集区、负压环境，保证空气不能对流，避免交叉感染，且采样点和检测室的距离需要间隔一定距离。
因此，需要分时间段按批送检，无法做到采集一个送检一个。
2. 标本转运
采样点采集完成的标本，转运员需要将每一个标本的条码信息核对一遍，然后放进专用的、严密包装的转运箱，并且需要对转运箱表面进行消杀，避免在转运过程中发生交叉感染。
标本转运至实验室后，并不是马上就能开始检验，而是需要转运人员
和标本接收人员同时进行仔细的信息核对、交接。
3. 标本签收及录入
交接完毕后，工作人员逐一拆开包装，将每一份标本的信息人工录入系统，这个“上户口”的过程，是为了保证每个样本信息的准确性、更好地对接大家的天府健康码。在检验结果出具后，方便大家在医院的信息平台和天府健康通等通用平台上及时查询到。
4. 提取核酸
信息核对无误后，专业技术人员将标本里面核酸提取出来，再进行扩增。
5. 配制试剂
多少份标本就需要配制多少份试剂、多少份 EP 试管，又是几千个枪头的工作量，全手工分装。
6. 加样
提取好的核酸只需要加入 5ul（容积单位：微升，相当于 1000000 分之一升。1 微升=1 立方毫米）进入试剂体系进行扩增。5ul 什么概念？一滴水的十分之一（大概 20 滴水是 1ml）。
刘刚解释说 ：从提取核酸、配置试剂到加样的步骤，全部依靠人工。这个过程耗时 30 分钟到 1 小时左右。
7. 上机检测
经历了层层工序，终于来到这个最核心的环节——上机检测。
刘刚解释说 ：单上机检测这个过程就需要 1 到 2 个小时，而且仪器一旦启动扩增程序是不能停下来中途添加新的标本的，必须要等这一批的结
果扩增完成后，才能进行下一批标本。这也是为什么核酸检测不能做到随到随测的原因之一。
“就像蒸馒头，不可能一锅馒头正蒸着，说打开加一个进去，肯定不行，必须要这一锅蒸熟之后，才进行下一锅。”刘刚说。好消息是，因为前期信息录入工作已经完成，上机检测的结果出具后，可直接与被检人员的信息匹配，不需要再次录入。
也就是说，在这个步骤完成、并经医生签字后，被检人员就可以在相应的平台查询到自己的核酸检测结果了。
篇六：核酸如何检测
章 核酸检测技术核酸检测技术
直接对动植物有害生物 基因序列 和 结构 进行测定。
核酸的分离纯化 PCR技术 核酸杂交技术
第1节 核酸的分离纯化
核酸的分离纯化的原则 1. 保持核酸一级结构的完整性 2. 提高核酸制品的纯度
技术路线的设计
破碎细胞的方法 机械 （匀浆、超声破、研磨等）
非机械 （化学处理、生化法）
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。
优点 缺点 乙醇 对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响后续实验 需要量大，低温操作 作 异丙醇 需体积小，速度快，一般不需低温长时间放置 易使盐类、糖类与DNA 共沉淀；异丙醇难以挥发除去
核酸浓度检测与完整性测定方法 浓度 测定
紫外分光光度法
260nm
荧光光度法
EB荧光 完整性测定 琼脂糖凝胶电泳法：以EB 为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。
基因组DNA 片段如发生降解，电泳图呈拖尾状； ； 完整的或降解很少的总RNA 电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值
问题一：DNA 样品不纯
抑制后续酶解和PCR 反应 DNA 提取常见问题
DNA 提取常见问题 问题 二：
：
DNA 降解
DNA 提取常见问题 问题 三：
：
DNA 提取量少
真菌 昆虫
第2节 PCR扩增技术 PCR, a „DNA photocopier‟
PCR技术简史 • DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 • 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 • 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 PCR技术简史 • DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com 1989 年美国《 《Science》 》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首, 比喻1989年 年为 为PCR 爆炸年,Mullis 荣获1993 年度诺贝尔化学奖。
1. PCR的基础
Polymerase Chain Reaction PCR The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.
Polymerase Chain Reaction The products of the first reaction become substrates of the following one, and so on. PCR
Polymerase Chain Reaction PCR Components ：
Thermostable DNA Polymerase ， Target DNA ，Pair of Primers ， dNTPs ， Mg ++
ions ， Buffer solution
Denaturation ：The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ Primer annealing: The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg 2+ . The PCR cycle: Three different steps in each PCR cycle
PCR 的扩增？
How does PCR work The first cycle The second cycle
How does PCR work The third cycle The fourth cycle
2. PCR的类型
1. 多重PCR（multiplex PCR）
2. 巢式PCR（nested PCR）
3. 定量PCR（quantitative PCR）
4. 不对称PCR（asymmetric PCR）
5. 反向PCR（inverse PCR）
6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR）
7. Overlap PCR
… …
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY • Typically generates a product band for each primer pair 多重PCR（multiplex PCR）:What 2.1 多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR:
Why • Detect several genes at once – eg. transgenic plant screen • Internal controls – VERY important – Tells you how well the PCR reaction worked – Reduces “false negatives” – Reduces “false positives”
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR:
How • Same as regular PCR • Care in primer design – Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
多重PCR（multiplex PCR）
A Typical Multiplex PCR Reaction Sterile Water
34.0 ul 10X PCR Buffer
5.0 ul MgCl2 (50mM)
2.5 ul dNTP’s (10mM each)
1.0 ul
Primer1FWD
1.0 ul
Primer1REV
1.0 ul
Primer2FWD
1.0 ul
Primer2REV
1.0 ul
Primer3FWD
1.0 ul
Primer3REV
1.0 ul DNA Polymerase
0.5 ul DNA Template
1.0 ul
Total Volume
50.0 ul 多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR:
Example • Three primer pairs – Control, resistance, and trait genes • Control gene fragment is largest and (almost) faintest • Trait gene is smallest and brightest Resistance Gene Trait Gene Control Gene Primers 多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR:
Example • Three primer pairs
Resistance Gene Trait Gene Which are transgenic? Control Gene Primers 多重PCR（multiplex PCR）
Nested Multiplex PCR 2 nd
Stage PCR Dilute 100 fold Between 1 st
& 2 nd
stage reactions 1F 1R 2R 3R 5R 6R 3F 2F 6F 4F 5F 4R Primary Multiplex RT-PCR
多重PCR（multiplex PCR）
2.2 定量PCR（quantitative PCR）
实时荧光定量PCR （Real time Quantitative PCR ）：
在 在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR 进程，对起始模板进行定量分析的方法。
Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint detection
荧光定量PCR 技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
与常规 PCR 技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
（ （1 ）定量原理 三个概念：
扩增曲线、荧光阈值、 Ct 值
如何对起始模板定量？
通过 Ct 值和标准曲线对 起始模板 进行定量分析
荧光定量 PCR 原理
—— 扩增曲线
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团
荧光检测元件
荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段 ：基线期、 指数增长期 和 平台期。
。
Cycle （循环数）
Rn （荧光强度）
基线期 平台期 平台期
荧光定量 PCR 原理 —— 荧光域值
Cycle （循环数）
Rn （荧光强度）
基线期 指数扩增期 平台期 荧光域值
手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段
荧光定量 PCR 原理 —— Ct 值
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
C(t) value
纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量 Ct 值的特点 ：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 Ct 值的重现性
定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X 0 *2 n •非理想的PCR反应：
•
X=X 0
(1+Ex) n
•
n：扩增反应的循环次数 •
X：第n次循环后的产物量 •
X 0 ：初始模板量 •
Ex：扩增效率
扩增效率 E （ （amplification efficiency）
）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。
在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。
扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10 -1/K -1（K为该直线斜率）即可计算出E值。
在扩增产物达到阈值线时:
X Ct =X 0
(1+Ex) Ct
=M
(1)
X Ct : 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.
在阈值线设定以后, 它是一个常数, 我们设为M
方程式(1) 两边同时取对数得:
log M=log X 0
(1+Ex) Ct
(2)
整理方程式(2) 得:
log X 0 = - log(1+Ex) *Ct+ log M
(3)
CT = - k lg X 0 + b （线性方程）
LogX 0 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到 域值的循环数即Ct值 值 就可计算出样品中所含的模板量。
标准 曲 线：
：CT 值对[DNA] 0 作图
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。
Cycle number Ck 10 4 Ck 10 2 Sample Log of DNA concentration
（ （2 ）荧光定量PCR 的化学原理 1. Hydrolysis probes （水解探针）
(TaqMan, Beacons)
2. DNA-binding (intercalating) agents （结合）
(SYBR Green, Eva Green, LC Green) 3. Hybridization or FRET probes （杂交）
(Light Cycler)
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
4、Amplisensor Q Q R DNA 产物的荧光标记
SYBR Green 法
SYBR Green
能结合到双链DNA 的小沟部位
SYBR Green
只有和双链DNA 结合后才发荧光
变性时，DNA 双链分开，无荧光
复性和延伸时，形成双链DNA ， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
信号强度与DNA 分子总数目成正比。
。
SYBR Green
5‟ 3‟ 5‟ 3‟ SG No Emission SG SG SG Excitation
SG SG SG SG SG SG SG 5‟ 3‟ 5‟ 3‟ Emission Excitation
SYBR Green 法优缺点
对DNA 模板没有选择性
---- 适用于任何DNA 使用方便
----- 不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 优
点
容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性
但可以通过 融解曲线的分析 ，优化反应条件
对引物特异性要求较高 缺 缺
点
Tm 值：DNA 解链一半时的温度 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
与目标序列互补 TaqMan 法 TaqMan--- 水解型杂交探针
5′ 端标记有报告基团(Reporter, R)
，如FAM 、VIC 等
3′ 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
探针完整，R 所发射的荧光能量被Q 基团吸收 ，无荧光， R 与Q 分开，发荧光
Taq 酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探针
每扩增一条 DNA 分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光
TaqMan 法优缺点
对目标序列的高特异性
------ 阴性结果确定
设计相对简单
------ 与目标序列某一区域互补 重复性比较好 优 优 点
只适合一个特定的目标
委托公司标记，价格较高
不易找到本底低的探针 缺 缺 点
Title=(Real-time PCR)
Timespan=2009-2012.
Published Items in Each Year
Examples of SYBR Green real-time PCR assays for detection of plant pathogenic
fungi (last 6 years)
（ （3 ）定量方法 绝对定量（ （Absolute Quantification）
）
确定未知样本中某个核酸序列的 绝对量值 ， 即通常所说的拷贝数。
。
相对定量（ （Relative Quantification）
）
测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的 相对变化。
。
2 - △C （t）
）
双标准曲线法
相对定量中的内标 • 内标通常是β-actin 、GAPDH 基因等看家基因
• 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小
• 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA 和体外转入的RNA
相对定量：参照因子Calibrator
相对定量分析方法1
-ΔΔCt
相对定量分析方法2：
：
双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同
特异性
重复性
灵敏度
其他问题
常见问题讨论
扩增的特异性
引物？ Tm ，重新设计引物，优化条件 Tm
重复性 --- 判断实验优劣的重要指标
判断指标 ：主要为标准差（SD ）和变异系数（CV ）
影响重复性的因素 ：
：
PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 。
目的基因的初始浓度：
使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。
标准曲线的影响：不少于5 个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA 。
影响灵敏度的因素
反应体系中形成的引物二聚体的影响
可以用水解探针代替SYBR Green I， ， 有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I 高出10倍 倍。
。
可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq 酶 要尽可能地...
篇七：核酸如何检测
冠状病毒核酸标本的检测及注意事项1标本采集 标本接收 标本灭活 核酸扩增 高压消杀文件体系报告发放生物安全核酸提取新冠核酸检测全流程及环节快检或含胍盐管2
新冠核酸检测实验室分区设置及功能标本制备区 试剂准备区 产物分析区 扩增区3
医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册（试行第二版）（ 2020 年 12 月 28 日）新冠核酸检测实验室分区设置及功能4
1. 操作区域：试剂准备区。该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备；2. 试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂；3. 试剂的质检；4. 耗材的质检（生产、破损）。核酸检测准备-试剂和耗材5
6核酸检测准备-场所和防护
7核酸检测准备-场所和防护
标本前期处理（小样本量）1. 标本接收- - 安全柜内开箱，清点，签字- - 热灭活( ( 含胍盐管无需热灭活) )2. 安全柜内拆密封袋- - 编号- - 录入信息大规模核酸筛查时 ， 可根据工作实际情况 ， 单独设置样本接收及前处理区域 ， 专人负责标本前处理以提高工作效率核酸检测-样本处理8
从3 3 合1 1 到 10 合1 1 混采检测技术混采：将采集自数人（如 3,5 或 10 人）的数支拭子集合于1 1 个采集管中进行核酸检测的方法。3 3 人混采：北京5 5 人混采：浙江、武汉、北京、新疆10 人混采：青岛，烟台，厦门样本处理-混采与混检9
http://www.gov.cn/xinwen/2020-08/19/content_5535756.htm10样本处理-混采与混检
11样本处理-混采与混检
12样本处理-混采与混检“ 混检 ”：即将不同的单个采样的被检者标本，在病毒核酸检测前，对每份（如10份或5份等）标本各取等量（如200 µL）混合在一起，混匀后，再按检测试剂说明书取一定体积（如200 µL ），按程序进行检测。也就是将不同的单个采样的被检者标本混合在一起进行检测。
“混检”：几个缺点：1. 没有减少采样管的使用，反而增加实验室的工作量；2. 容易因为混合样本出现差错；3. 降低检测分析敏感性，会造成较弱阳性标本不能检出Ct值大小与原始模板量之间的关系：Ct=(-1/log(1+E))LogX2混1：
浓度稀释1倍，Ct值升高1.00；3混1：
浓度稀释3倍，Ct值升高1.58；5混1：
浓度稀释5倍，Ct值升高2.32；10混1：浓度稀释10倍，Ct值升高3.32(扩增效率100%时)；Eff= 10^ (–1/Slope) –1Slope在-3.1~-3.59之间对应的扩增效率范围是90%-100%。13样本处理-混采与混检
新冠标本核酸提取14人员基本要求核酸检测技术人员应具备相关专业 大专以上学历或 中级及以上专业技术职务任职资格，并有2 年以上的实验室工作经历和 基因检验相关培训合格证书。核酸快速检测实验室人员需要通过临床基因扩增检测实验室上岗培训，取得相应资质，且经过2019-nCoV核酸快速检测的基本培训和工作能力的评估后方可上岗。
新冠标本核酸提取15实验前安全要求使用0 0. .2 2% % 含氯消毒剂或 75% % 酒精进行桌面、台面及地面消毒。转运至实验室的标本转运桶应 在生物安全柜内开启。如发现标本渗漏应立即用吸水纸覆盖，并喷洒有效氯含量为0.55%的含氯消毒剂进行消毒处理，不得对标本继续检测操作，做好记录后需立即进行密封打包，压力蒸汽灭菌处理后销毁。实验中安全要求如为采样管为非灭活管，进行标本热灭活时，需旋紧标本采集管管盖；温浴过程中可 每隔 10 分钟将标本轻柔摇匀1 1 次，以保证标本均匀灭活；温浴后标本 需静置至室温至少 10 分钟使气溶胶沉降，随后再开盖进行后续核酸提取。
新冠标本核酸提取16实验结束后清洁要求. 1. 空气清洁：紫外照射2小时以上。必要时可采用核酸清除剂。. 2. 台面清洁：实验后使用0 0. .2 2% % 含氯消毒剂或 75% % 酒精进行台面、地面清洁。. 3. 生物安全柜消毒：试管架、实验台面、移液器等使用75%酒精进行擦拭。随后关闭生物安全柜，紫外灯照射30分钟。. 4. 转运容器消毒：转运及存放标本的容器使用前后需使用0 0. .2 2% % 含氯消毒剂或75% % 酒精进行擦拭或喷洒消毒。. 5. 塑料或有机玻璃材质物品清洁：使用0.2%含氯消毒剂或过氧乙酸或过氧化氢擦拭或喷洒
检测系统的配套问题：核酸提取试剂、核酸提取仪、荧光RT-PCR扩增检测试剂盒、荧光PCR扩增仪（四个不同部门，不同层级的批准证书）如达安核酸检测试剂盒说明书：配套提取试剂—本公司生产的xxx号，xxx号；配套扩增仪—ABI7500，LightCycler480。原因：各个提取试剂的吸附效率、加样量、洗脱体积不同；如磁珠法：提取试剂A加样量为200μL，洗脱体积为30μL；提取试剂B的加样量200μL，洗脱体积100μL，因此即便两种试剂磁珠吸附效率相同，试剂A提取核酸浓度可能是试剂B的3倍。新冠标本核酸提取发动机-变速箱-轮胎… … 配套装配与配套验证17
以采用之江试剂，自动提取仪提取为例配制蛋白酶K、助沉剂和内标混合液：RNA助沉剂加入500μl助沉剂溶解缓冲液溶解并混匀，未用完的RNA助沉剂可在4℃保存6个月组分 体积/每人份蛋白酶K 20μl/每人份RNA助沉剂 6μl/每人份内标 1μl/每人份新冠标本核酸提取18
深孔板A 行朝左置于核酸自动提取仪，插入磁套，选择RNA Isolation 2 ，点击Start运行结束，点击STOP 键停止蜂鸣，丢掉磁套，取出深孔板预装板颠倒几次再手甩数次( 编号) ，使液体置于孔底，撕开铝箔膜在预装板A 行加入300μl 样本，27μl 混合液（蛋白酶K 、RNA 助沉剂及内标混合液）吸取E 行洗脱的核酸到1.5ml 离心管中，传递窗传给扩增人员实验流程图新冠标本核酸提取19
新冠标本核酸扩增20（来自国家卫健委临床检验中心）无论是PCR法还是等温扩增法，都需在临床基因扩增实验室进行，要求有实验室分区和防核酸污染程序核酸检测方法
21结果判读、数据处理及注意事项 基线(Baseline)：从 第3 个循环起到CT 值前3 个循环止的荧光信号，终点根据每次实验具体数据调整，一般取第3到第15个循环之间。 阈值（Threshold）
）：是基线范围内荧光信号强度 标准差的10 倍数值。 CT 值: 在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数。
阈值所在横线与PCR 扩增曲线的交点所指的PCR循 循环次数就是CT值 值。
22结果判读、数据处理及注意事项1. 原始数据分析：根据分析后图像调节基线的起始值（第3-15个循环）、终止值（5-20个循环）及阈值，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。
但当阴性质控品出现扩增曲线时 ， 实验室应警惕并排除污染的可能 。2. 结果有效性分析：试剂盒中的阴性质控品和阳性质控品未参加提取，仅代表扩增和产物分析过程是有效的，不能监测提取过程的有效性，因此实验室还应在每批检测中设置至少1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5-3倍）并随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。根据试剂盒说明书确定阳性判断值、结果判读规则和复检规则。
23内对照结果的判读：根据Ct值和扩增曲线判断内对照是否为阳性。如果内对照阳性，则该标本结果为有效。当内对照为阴性，而靶基因也为阴性，则该标本的结果无效。如内对照和靶基因同时阴性，则该标本可能在 标本采集、核酸提取和核酸扩增的某个环节存在问题，需要复检或重新采样。结果判读、数据处理及注意事项
24新冠标本核酸扩增检测中临床标本多为内对照阳性，因此 内对照污染风险高于SARS-CoV-2靶核酸。由于试剂盒阴性质控品中内对照也为阳性，因此实验室应在日常检测中通过检测 不含内对照的阴性质控品（如生理盐水），以监测内对照污染的发生情况。如果内对照污染 ， 将失去对标本采集 、 核酸提取和扩增过程的监控作用 。内对照污染如何监控？
25结果判读、数据处理及注意事项各靶区域结果的判读：根据试剂盒的提供的阳性判断值进行。但对于弱阳性结果的判读，如出现 典型S S 形扩增曲线 ， 但 Ct 值> > 40,应高度怀疑可能为弱阳性结果，可重复检测或重采样以确认。为避免污染造成的假阳性对结果造成干扰，实验室检测中应加入 足够的阴性质控品（建议不少于3个），既排除污染了造成的假阳性的可能，又有助于区分真正的弱阳性结果。为什么要检测三个阴性质控品?现在大规模人群筛查，所检标本基本上都是阴性，有否必要做三个阴性质控品?回答：问得好！一个阴性质控品都可不做，但此时，每一份标本都是阴性质控，一旦标本出现阳性，即视为失控！李金明，新型冠状病毒核酸大规模筛查的关键问题（210806）
26原始数据分析结果有效性分析标本结果判读结果判读、数据处理及注意事项
试剂厂家 检测区域 反应体系(µL) 加样体系(µL) 总体系 检测下限（copies/mL）
结果判读达安基因 ORF1ab/ N 20 5 25 500双靶标均阳性，判阳性，单一靶标阳性，复检仍为阳性，判阳性。否则，为阴性。湖南圣湘 ORF1ab/ N 3020（样本释放剂提取后）50 200 双靶标之一或同时阳性，判阳性；否则，判阴性。卡尤迪 ORF1ab/ N35（快速程序需添加2µl快速反应增强剂）15（样本处理液处理后）50 400双靶标均阳性，判阳性，单一靶标阳性，复检仍为阳性，判阳性。否则，为阴性。优思达 ORF1ab/ N /500 （咽拭子）200 （痰）/ 1000 双靶标之一或同时阳性，判阳性；否则，判阴性。厦门安邦（杂交捕获免疫荧光法）ORF1ab/ N/E100 20 120 500Cut-off值≥100为阳性，Cut-off值＜100为阴性。检测结果不能区分ORF 1ab基因、N基因、E基因，不能完全避免存在其他近源冠状病毒的交叉影响。………… …… …… …… …… ……国家药监局已批准的部分快检试剂及特点27
质量控制：应覆盖人，机，料，法，环等各个环节室内质控：设置1个第三方的弱阳性质控(检测限1.5-3倍)参与从提取到扩增的全过程。注意：
如购买高浓度质控品稀释成弱阳性质控，应特别注意防止质控品造成的实验室污染。快检室内质控：每次开机前，先检测弱阳性质控品和阴性质控品，质控合格后，开始进行临床标本检测，每隔24小时或连续检测50个样本后，均需再次检测弱阳性质控品，监测是否在控。室间质量评价(EQA)质量控制假阴性：降解，提取效率，扩增失败；—弱阳性质控假阳性：标本之间交叉污染（包括试剂盒阳性对照），扩增产物污染28
①SARS-CoV-2核酸检测为何要做性能验证？②性能验证内容？-注意“ 配套检测系统”概念，是系统验证而非单纯试剂验证③采用什么样本进行性能验证？— 最优样本，可替代样本④性能验证需多少样本？—取决于 性能参数评估时实验室预期想达到多大的统计学置信水平及置信区间。例如: 实验室预期验证某试剂阳性符合率（95% CI 93.2~100%）时，用5个阳性样本，检出4个阳性结果，阳性符合率80%不符合厂家宣称的CI范围。如果用30个阳性样本，检出28个阳性结果，则阳性符合率93.3%则达到了厂家宣称的CI区间。为满足统计学要求，一般阳性样本数不低于20~50例。但由于COVID-19的应急性和特殊性，可将性能验证看作一个连续且不断完善的过程。质量控制-性能验证29
准确度(Accuracy) 验证准确度：即为 检测结果和真实结果的一致程度，是所有检测试剂必须验证的性能指标之一。可参照试剂说明书上描述的性能确认方案进行设计。但绝大部分国产新冠核酸检测试剂说明书上只有性能确认后的结果而无性能确认过程，此时可参照国外FDAEUA授权试剂说明书进行检测性能验证方案设计。对于新型冠状病毒检测最为重要的性能指标则为 准确度(Accuracy) 、 、 精密度(Precision) 和检测限(limit of detection, LOD)。质量控制-性能验证30
取SARS-CoV-2 阴性及阳性样本各 各20例 例进行待验证方法与参比方法的平行检测。其中，阴性样本可为既往的其他呼吸道感染或其他疾病患者的临床样本；阳性样本最优为COVID-19确诊患者的临床样本，也可使用添加有灭活新型冠状病毒的临床样本、添加有灭活新型冠状病毒RNA的临床样本或人工模拟样本。根据检测结果绘制2×2表，计算阳性符合率(Positive Percent Agreement, PPA）和 阴性符合率(Negative Percent Agreement,NPA）。若PPA 和NPA 均≥95%， ， 则为达到厂家宣称的准确度水平。质量控制-性能验证31
精密度（ （ Precision）
）
评价实验室可利用新冠病毒核酸检测定值标准品或精准定值的模拟样本进行试剂最低检测限及精密度验证。实验室可 将定值标准物质按2-3 倍梯度稀释至厂家声明的检出限浓度(如 如500 copies/mL) 以下 ， 每个浓度梯度重复测定10 次。若阴性样本(即稀释浓度低于C 5 或为零浓度样本)阴性检出率为100%(10/10)；弱阳性样本（即稀释浓度略高于LOD的样本）阳性检出率为100%(10/10)；中/强阳性样本阳性检出率为100%(10/10)，同时阳性样本的重复检测Ct值CV＜5%，则检测精密度验证通过 [1-2] 。（C 5 ：检测浓度为C 5 的分析物时将产生5%的阳性结果。用浓度<C 5 的样本进行重复性检测时，将得到阴性结果。）[1]
中国合格评定国家认可委员会. 分子诊断检验程序性能验证指南（CNAS-GL039）. 2019. [2]
中国合格评定国家认可委员会. 临床免疫学定性检验程序性能验证指南（CNAS-GL038）. 2019.质量控制-性能验证32
检测限(limit of detection, LOD) 评价美国CLIA并不强制要求实验室开展检测试剂LOD的验证。但在我国，根据CNAS发布的《分子诊断检验程序性能验证指南》建议，在所用检验程序在厂商试剂使用说明书有检测限声明时、有标准物质时或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证 [1] 。实验室可通过利用新冠病毒核酸检测定值标准品或精准定值的病毒模拟样本进行，如可将定值标准物质按2-3倍梯度稀释至厂家声明的检出限浓度（500 copies/mL）以下，随后每个浓度梯度使用检测试剂重复测定10次。如果≥95%LOD浓度以上的样本检测呈阳性，则该试剂的LOD验证通过。[1]...
篇八：核酸如何检测
冠状病毒核酸检测方法原理和结果判读张 瑞国家卫生健康委临床检验中心新型冠状病毒核酸检测标本采集（标本保存液）• 普通标本保存液（非灭活型）• 含胍盐的标本保存液（灭活型）标本灭活• 热灭活• 保存在含胍盐的灭活型标本保存液中的标本，无需进行热灭活处理核酸提取（核酸提取试剂）• 磁珠法• 柱提法• 一步法（快速裂解法）核酸扩增和产物分析（核酸检测试剂）• 基于逆转录PCR扩增的方法• 基于等温扩增的方法
标本采集——标本保存液
标本采集——标本保存液新型冠状病毒核酸检测试剂盒说明书本试剂盒不包含但检测必需的配套病毒保存液： 含胍盐的病毒保存液：××有限公司的样本保存液（苏泰械备××号） 可分离病毒的保存液：
××的病毒采样试剂盒（京械注准××号）、 ××的一次性使用病毒采样管（苏泰械备××号）、 ××的细胞保存液（浙甬械备××号）、 ××有限公司的转运培养基（苏泰械备20200114号）或者3mL生理盐水（0.9%的氯化钠水溶液）。 普通标本保存液（非灭活型）：本身不含有抑制RNase的成分，需要依靠低温对RNase活性的抑制来避免病毒RNA的降解。保存在普通标本保存液中的标本需要在低温条件下运输。 含胍盐的标本保存液（灭活型）：胍盐不但可以失活RNase，而且可裂解病毒使其灭活。标本可在室温保存一定时间。标本保存液
标本采集——标本保存液某实验室，接受不同来源送检的标本，使用的采样管各不相同（5种以上），包括不同厂家生产的灭活型和非灭活型标本保存液，后续实验室检测为相同程序，你认为可能存在什么问题？ 标本运输、保存温度条件和时间要求不同，对这一过程很难控制。 保存在含胍盐的灭活型标本保存液中的标本，无需进行热灭活处理。 从非指定的病毒裂解液中提取核酸可能导致RNA模板中存在微量胍盐，可能对后续核酸提取及扩增过程造成影响，应使用厂家推荐的含胍盐灭活型标本保存液。 如果使用其它保存液，应首先进行性能确认，评估保存液对提取和检测过程是否存在影响。 “一步法”提取的试剂通常必须使用其指定的保存液（非灭活型）。
核酸提取方法
室间质评中使用的核酸提取方法磁珠法是最常用的核酸检测方法，多使用自动化提取仪
磁珠法去除PCR抑制物、增加靶核酸浓度（浓缩富集）、增加标本中核酸的均一性标本量200µl核酸量100µl
柱提法去除PCR抑制物、增加靶核酸浓度（浓缩富集）、增加标本中核酸的均一性QIAGEN的离心柱提取试剂需要取用140 µL标本，最终洗脱体积为60 µL
一步法（快速裂解法）病毒裂解，核酸释放部分沉淀蛋白质和人基因组DNA，纯化的核酸快速简便无法达到磁珠法和离心柱法对PCR反应抑制物的去除效果。没有浓缩富集步骤，获得的核酸浓度低于磁珠或离心柱提取法。必须使用厂家配套的标本保存液，不能使用含胍盐的保存液。标本量10µl核酸量20µlXX XXX X XX
室间质评中临床实验室使用的核酸提取试剂超过58种室间质评中使用的核酸提取试剂情况
• 各核酸提取试剂的磁珠吸附效率、用于核酸提取的样本量、洗脱体积也各有不同。
以磁珠法提取为例，提取试剂 A 用于核酸提取的样本量是 200µL，洗脱体积为 30µL；提取试剂 B 用于核酸提取的样本量是 200µL，洗脱体积为 100µL， 因此，即使两种提取试剂磁珠吸附效率相同，试剂A提取核酸浓度有可能是试剂B的3倍。• 建议使用核酸检测试剂推荐的提取试剂。使用“中山大学达安基因股份有限公司核酸检测试剂”的224家实验室， 仅有58家使用配套的核酸提取试剂。• 相同核酸提取试剂，各实验室的检测程序也有所不同。各实验室使用的核酸提取的样本量均为 200µL，但洗脱体积包括 40、50、60、80、90 和 100µL 等。室间质评中使用的核酸提取试剂情况
核酸检测方法
室间质评中使用的核酸检测试剂情况
新型冠状病毒核酸检测试剂分类医学实验室使用• 新型冠状病毒• 绝大多数试剂均属于此类• 大规模人群检测需求现场即时检测• iPonatic核酸检测分析仪（NMPA批准）• ID NOW COVID-19 assay多种病原体联合检测• 新型冠状病毒• 甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒等多种常见的呼吸道病原体（或亚型）即使检测出其它呼吸道病原体，新型冠状病毒核酸阴性，由于假阴性的问题，也不能排除新型冠状病毒感染。
实时荧光RT-PCR高分辨熔解曲线分析数字PCRPCR-Luminex高通量测序PCR-飞行时间质谱PCR-基因芯片基于逆转录PCR扩增的方法 基于等温扩增的方法依赖核酸序列扩增技术（NASBA)转录介导的扩增技术(TMA）环介导等温扩增技术（LAMP）核酸检测方法无论是PCR法还是等温扩增法，都需要在临床基因扩增检测实验室进行，有实验室分区和防污染的程序。
室间质评中使用的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法是最常用的核酸检测方法
RNA逆转录逆转录PCR扩增PCR扩增：变性—退火—延伸；变性-退火/延伸
1 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconNo. of No. Amplicon CyclesCopies of Target1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82430次循环后靶序列扩增的数量如果扩增30个循环，DNA产物理论上可达到约10亿个拷贝
实时荧光RT-PCR
基线：PCR反应起始阶段，扩增产物很少，产生的荧光信号很低。基线荧光信号可根据此阶段产生的荧光信号来计算。阈值：基线信号的10倍标准差。Ct：扩增过程中荧光信号强度超过阈值的循环数。a: 平台期b: 指数期c: 指数期初期d: 线性基线期e: 基线实时荧光PCR的基本原理
核酸检测的结果分析
新型冠状病毒核酸检测结果分析原始数据分析结果有效性分析样本的结果判读
原始数据分析实时荧光RT-PCR法核酸检测试剂盒说明书【结果分析】（请参照各仪器使用说明书进行设置，以ABI 7500仪器为例）反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。数据分析过程 实时荧光RT-PCR法的原始数据分析，就是将该批次临床标本产物分析中，每个循环检测到的荧光值转化为可以判定阴阳性的数值。 基线设定、阈值线确定和Ct值分析。
基线分析【试剂说明书】反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20。A. 当基线采集设定在2-4个循环时，荧光值去除本底不足；B. 当基线采集设定在5-15个循环时，荧光曲线的变化变为清晰。
基线分析【试剂说明书】反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20。A. 当基线采集设定在3-6个循环时，荧光值去除本底不足；B. 当基线采集设定在5-16个循环时，荧光曲线的变化变为清晰。。
阈值确定【试剂说明书】反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。A. 当阈值线未按照要求设定时；B. 当阈值线正确设定在指数期初期部分标本得到完全不同的阴阳性结果阈值应位于指数扩增期的初期
阈值确定A. 当阈值线未按照要求设定时，阴阳性结果的区分并不清晰；B. 当阈值线正确设定在指数期初期时，阴阳性结果判定非常清晰。“阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线”是正确的吗？如果阴性质控品的扩增曲线出现上升时，实验室应当警惕并排除污染的可能，而不是强行将阈值线设定高于阴性质控品的曲线。
Ct值分析【试剂说明书】反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。Ct值：扩增过程中荧光信号强度超过阈值的循环数。
Ct值分析【试剂说明书】反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。
Ct值分析Ct值和样本中新型冠状病毒核酸量存在什么关系？
基于PCR扩增的原理，如果Y n 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为扩增效率，n为扩增循环数，那么每一轮循环产生的PCR产物的量为：Y n = X （1+E）
n
（1）在扩增达到阈值线时，n = Ct，于是，扩增产物的量为：Y Ct = X （1+E）
Ct
（2）对公式（2）两边取对数，可以得到：Log Y Ct = LogX （ 1+E ）
Ct （3）从而，得到Ct值和Log X 的关系如下：Ct =（ -1/log（1+E））
Log X +Log Y Ct / log（1+E）
（4）在扩增效率E=100%的情况下，两份样本Ct值的差为：Ct值（标本1）–Ct值（标本2）=-3.32 Log X1/X2
（5）基本计算公式的推导 核酸初始量每相差10倍，标本检测的Ct值就相差3.32个循环； 如果两份标本相差1个、2个、3个Ct值，两份标本的浓度相差为2倍、4倍和8倍。
如果扩增效率E不是100%，而是50%，两份样本Ct值的差为：Ct值（标本1）–Ct值（标本2）=-5.68 Log X1/X2
（6） 即核酸初始量每相差10倍，标本检测的Ct值相差5.68个循环。 如果实验室采用10倍梯度稀释标本进行SARS-CoV-2核酸检测的性能验证，Ct值差大于3.32，说明PCR扩增效率较低；Ct值相差越大，说明反应体系PCR扩增效率越低。基本计算公式的推导 举例：某实验室新型冠状病毒室间质评结果不合格，7个阳性样本仅检出3个，10 5 以下全部未检出。寻找不合格原因。 再次提供10倍梯度稀释样本给该实验室（ 4×10 3 ~4×10 6 ）。
某实验室新型冠状病毒室间质评结果不合格原因分析ORF1ab区结果4份阳性样本ORF1ab区Ct值依次为：30.32，36.08，36.40，38.92.10 610 5 10 4 10 3阳性对照
N区结果4份阳性样本N区Ct值依次为：26.69，32.12，34.05，35.30.某实验室新型冠状病毒室间质评结果不合格原因分析10 610 510 410 3阳性对照
结果有效性分析实时荧光RT-PCR法核酸检测试剂盒说明书【质量控制】阴性质控品：FAM和VIC检测通道无明显扩增曲线，Cy5通道有明显扩增曲线；阳性质控品：FAM和VIC检测通道有明显扩增曲线，Ct值≤32，Cy5通道有或无扩增曲线；结果有效性分析过程 在数据分析完成后，应首先分析的不是临床标本的结果，而是试剂盒阴性质控品和阳性质控品的结果，这一过程是对该批检测结果是否有效的最基本判断。 试剂的质量、实时荧光RT-PCR仪的性能和反应体系配制等都有可能影响检测结果。
阳性对照结果阳性质控品的局限性：试剂盒中的阴性质控品和阳性质控品如果是DNA片段（如质粒），不能监测核酸提取过程的有效性，仅代表扩增和产物分析过程是有效的。由于浓度较高（如举例的试剂阳性质控品Ct值≤32，实际浓度可能更高），因此不能及时发现问题。个别实验室参加了室间质量评价，才发现自己无法有效提取核酸，无法检出阳性标本！阳性对照阳性对照
标本的结果判读和复检 内对照结果的判读 各 靶区域结果的 判读 标本 定性结果的 判读
标本的结果判读和复检实时荧光RT-PCR法核酸检测试剂盒说明书【阳性判断值】利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考值Ct值为40，内标Ct值为40。【结果判读】1. 如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40，且Cy5通道有扩增曲线，可判样品未检测到SARS-CoV-2 RNA；2. 如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，可判样品为SARS-CoV-2阳性；3. 如果检测样品仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一通道无扩增曲线，结果需复检，复检结果一致可判样品为SARS-CoV-2阳性；复检均为阴性可判断为未检测到SARS-CoV-2 RNA。【检验结果的解释】1. 每次实验均需检测阴性质控品，阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定；2. FAM和VIC检测通道为阳性时，由于体系的竞争关系，Cy5通道（内标通道）结果可能为阴性；3. 内标结果为阴性时，若该检测管的FAM和VIC检测通道也为阴性，说明体系受抑制或操作失误，试验无效，需对该样品进行复检。
内对照结果的判读举例1内对照阳性、靶基因阳性，结果有效
内对照结果的判读举例2内对照阴性、靶基因阳性，结果有效内对照ORF1abN
内对照结果的判读举例3内对照阳性、靶基因阴性，结果有效内对照ORF1ab N
内对照阴性、靶基因阴性，结果无效：如果是内源性内对照，该标本可能在标本采集、核酸提取和扩增过程的某个环节存在问题，因此需要复检或者重新采样。内对照结果的判读举例4
日常检测中临床标本多数为内对照阳性，因此内对照污染的风险更高于SARS-CoV-2靶核酸。由于试剂盒阴性质控品中内对照也为阳性，因此实验室应在日常检测中可以通过检测不含内对照的阴性质控品（如生理盐水），以监测内对照污染的发生情况。内对照污染如何监控？如果内对照污染，将失去对标本采...
