对照组选取同期该院健康体检者50例。采用酶联免疫吸附法（ELISA） 和流式细胞分析法，检测各组外周血LXA4、CD4+CD25+ CD127-Treg细胞水平，并进行相关性分析。结果 ACS组患者入院时外周血LXA4 水平显著高于对照组（P<0.01）；STEMI组患者外周血LXA4 水平显著高于UA组及NSTEMI组（P值分别为<0.05，<0.05）；ACS组患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4 +CD25+T细胞的百分率与对照组（P<0.01）相比显著较低；STEMI组患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率与UA组及NSTEMI组（P值分别为<0.05，<0.05）相比显著较低； CD4+ CD25+CD127-Treg细胞百分率和ACS患者血浆LXA4水平呈显著负相关（r=-0.653，P=0.004）。结论 通过检测ACS患者的CD4+CD25+CD127-Treg细胞及LXA4水平，能够对ACS患者的分型及预后有一定的指导意义。
[关键词] 急性冠脉综合症；脂氧素A4；CD4+CD25+ CD127-Treg细胞
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）10（b）-0078-04
Clinical Significance of Levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127- Treg cells in Peripheral Blood in Patients with Acute Coronary Syndrome
LIU Hong-jie1， LIU Lu-bin2
1.Department of Cardiology， Beianhe Community Health Service Center， Haidian District， Beijing， 100095 China；2.Department of Internal medicine， Beijing University Hospital， Beijing， 100871 China
[Abstract] Objective To explore the mechanism of the levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127- Treg cells in peripheral blood in patients with acute coronary syndrome （ACS） and discuss its role in diagnosis and prognosis of this kind of disease. Methods From March 2010 and March 2015， 154 ACS patients were eolled， including 49 cases of acute non-ST-elevation myocardial infarction （NSTEMI） as the NTESMI group， 53 cases of acute ST-elevation myocardial infarction （STEMI） as the STEMI group， 52 cases of unstable angina as the UA group. Other healthy people who received health check in the same period in this hospital were selected as the control group. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and flow cytometry were used to detect the levels of LXA4 and CD4+CD25+CD127-Treg cells in peripheral blood in all the patients and the correlation analysis was conducted. Results The level of LXA4 at admission was higher in the all the ACS patients than in those in the control group（P<0.01）， was higher in the STEMI group than in the UA group（P<0.05） and NTESMI group （P<0.05）. The proportion of peripheral blood CD4+CD25+CD127-Treg cells in CD4+CD25+T cells at admission was obviously lower in all the ACS patients than those in the control group（P<0.01）， was obviously lower in the STEMI group than in the UA group（P<0.05） and NTESMI group（P<0.05）. The proportion of peripheral blood CD4+CD25+CD127-Treg cells was negatively correlated with the level of LXA4， （r=-0.653， P=0.004）. Conclusion Detecting the level of CD4+CD25+CD127-Treg cells and LXA4 can provide guidance for the classification and prognosis of patients with ACS.
[Key words] Acute coronary syndrome； Lipoxin A4； CD4+CD25+CD127-Treg cells
急性冠状动脉综合症（acute coronary syndrome.ACS）， 是冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease，CHD）中的急症，约占冠心病的30%～40%左右，是较常见的致死性心血管疾病之一。ACS有三种：急性ST段抬高心肌梗死（ST segment elevation myo cardial infarction.STEMI）、不稳定型心绞痛（unstable angina，UA）、急性非ST段抬高心肌梗死（non—ST segment elevation myocardial infar ction，NSTEMI）[1]。ACS的主要是由于不稳定斑块中炎症细胞的积聚造成，当斑块破损或出现裂纹，从而将大量的炎症因子释放出来的时候，会使一系列的级联免疫反应来放大免疫细胞浸润产生，从而使得斑块破裂[2]。有研究认为，过度表达的局部炎性反应会造成缺血本身更严重的对缺血区心肌组织的损伤，所以，如何使其后过度表达的炎性反应得到抑制，使免疫调节性T细胞（Tr）和致病性T细胞（Tp）等实现动态平衡，进一步保护心肌细胞，是近年研究的重点[3]。脂氧素A4（Lipoxin，LX A4）是近年来人们发现的内源性化学介质，LX A4能时炎性细胞因子的产生得到降低，使中性粒细胞的活化和趋化得到抑制，是调节炎症消退的重要抗炎介质[4]。LX A4在炎性相关性疾病中越来越受到重视，在冠心病缺血再灌注的炎性反应中的作用及机制尚未见报道。该研究通过测定分析该院2010年3月—2015年3月收住的154例ACS患者外周血脂氧素A4（LXA4）与CD4+ CD25+ CD127+调节性T细胞（Treg）水平，不同分组间进行分析比较，以及进行相关性研究，探讨LXA4在ACS患者缺血再灌注的炎性反应中的机制和作用，以及其在此类疾病发病、预后过程中的作用。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
整群选择2010年3月—2015年3月来该院心内科住院并接受冠脉造影的ACS患者154例，其中男性87例，女性67例，平均年龄（59.62±17.84）岁。根据造影结果及其他辅助检查，将ACS患者分为不稳定型心绞痛（UA）组52例，其中男性29例，女性23例，平均年龄（61.73±13.59）岁；急性非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI） 49例，其中男性28例，女性21例，平均年龄（58.19±14.03）岁；急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）组53例。其中男性30例，女性23例，平均年龄（58.63±18.58）岁。各组在性别、年龄间差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有病例诊断符合2007年美国心脏病学会和美国心脏病协会（ACC/AHA）修订的诊断标准。患者均结合肌钙蛋白I、临床行心肌酶等生化标记物和冠状动脉造影检查使ACS得到确诊。所有确诊为冠心病的患者使用的基础药物治疗方案都相似，如氯吡格雷、硝酸酯类、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、阿司匹林、他汀类药物、p受体阻滞剂、利尿剂、钙拮抗剂等等。所有病例都将自身免疫性疾病或使用免疫抑制剂（如皮质类固醇）、心肌病、恶性肿瘤、严重心力衰竭、炎症性疾病、内分泌疾病、心内膜炎、严重肝肾功能不全等排除。对照组选取同期该院健康体检者，未发现心血管疾病者50例，其中男性28例，女性22例，平均年龄（59.13±16.65）岁，ACS各组和对照组在年龄、性别上的差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者及健康体检者均签署了知情同意书。
1.2 仪器和试剂
FC500型流式细胞仪，是在美国的贝克曼库尔特有限公司购买的。试剂当中主要包括：LXA4试剂盒购自美国A&D公司。以下均购于美国eBioscienee公司：人Treg染色试剂盒，规格100t的藻青蛋白-花青苷（PC5）标记的鼠抗人单克隆抗体CD25 mAb（抗CD25 m Ab）；规格100t的异硫氰荧光素（FITC）标记的鼠抗人单克隆抗体CD4 mAb（抗CD4 mAb）；规格100 t的藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人单克隆抗体CD127 mAb（抗CD127+ mAb）。
1.3 检测方法
采集两管ACS患者入院后清晨空腹静脉血每管3～4 mL，共5～8 mL。同时，对照组取空腹静脉血。LXA4测定：肝素抗凝，30 min内，常规离心， 将血清分离，在-80℃超低温冰箱将血清标本冻存待测。严格按照试剂说明书中描述的使用酶联免疫吸附法的夹心法实施检测。CD4+CD25+ CD127-Treg表达率测定： EDTA抗凝，标记细胞采用直接免疫荧光标记法，并进行流式细胞仪分析。操作步骤：取单克隆抗体CD127-PE、 CD25-PC5、 CD4-FITC，同型对照各20 μL，添加100 uL EDTA抗凝的外周血，在室温下实施避光孵育15 min，再添加500 μL红细胞裂解液，实施避光孵育10 min；加入PBS，洗2次，离心1500 转/5min，弃上清后，添加适量PBS。采用流式细胞仪进行检测，并对CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率进行计算。
1.4 统计方法
使用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以mean±SD表示，多个样本均数两两比较，运用LDS法方差进行分析，每两组间的比较用最小显著差法得t值。不连续变量采用χ2检验，采用Pearson相关分析和偏相关分析两个正态分布的连续变量之间的相关关系，P<0.05时，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ACS患者及正常对照组血浆LXA4水平
各组血清LXA4浓度经过方差齐性检验，结果为（F=9.138， P<0.01）具有方差齐性。ACS组患者入院时外周血LXA4 水平显著高于对照组（P<0.01）；STEMI组患者外周血LXA4 水平显著高于UA组及NSTEMI组（P值分别为<0.05）；UA组及NSTEMI组患者外周血LXA4 水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1 ACS患者及正常对照组血浆LXA4水平（x±s）
注：aP<0.01 vs对照组； bP<0.05 vsNSTEMI组；cP<0.01；vsUA组；dP>0.05 vsUA组。
2.2 CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率
STEMI组患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率与UA组及NSTEMI组（P分别<0.05，<0.05）相比显著较低差异有统计学意义；ACS组患者入院时外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率和对照组相比显著较低（P<0.01）； UA组及NSTEMI组患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率比较差异无统计学意义 （P>0.05）。见表2。
3 讨论
动脉粥样硬化，属于一种炎症性疾病。在动脉粥样硬化斑块的发生、发展的过程当中，炎症机制扮演着重要的角色。现有研究认为，炎症反应和易损斑块破裂互相为因果，使一个急性冠脉综合征（acute coronary sysndromes As）的恶性循环过程启动。内皮细胞损伤后炎症反应导致了动脉硬化斑块的形成是，在动脉粥样硬化的发生发展过程免疫及炎症反应反映了急性心肌缺血连续的病理生理过程[5-6]。该研究通过检测154例ACS患者血浆LXA4水平，分析比较其在ACS的早期诊断及临床分型中的临床意义。脂氧素A4（Lipoxin A4，LXA4）是机体在急性炎症反应时产生的一类脂质抗炎递质，在感染、损伤和炎症等过程中经跨细胞途径合成，能降低炎性细胞因子的产生[7]，是二十烷类家族中一类花生四烯酸的代谢产物，使中性粒细胞的趋化与活化受到抑制，是使炎症消退得到调节的重要抗炎介质[8]。该研究发现ACS患者入院时外周血LXA4 水平显著高于对照组，其中STEMI组患者外周血LXA4 水平高于UA组及NSTEMI组，UA组及NSTEMI组患者外周血LXA4 水平比较无差异。说明LXA4在ACS早期迅速升高，并与心肌缺血的程度呈正相关。该研究者前期研究也发现急性心肌梗死患者入院时血浆LXA4水平与对照组和48 h后相比显著较高。结合既往研究结果LXA4为炎症消退因子，其可能在ACS早期急性炎症反应的过程中可能起到了抑制炎症反应进一步级联扩大，保护心肌细胞的作用。但具体作用机制尚需进一步研究。进而提示研究人员也许能够通过检测ACS患者入院时外周血LXA4 水平，进一步预测ACS患者的病情及预后。
不只血管病变当中会发生冠状动脉粥样硬化中炎症的激活，活化外周血中的免疫细胞也会发生冠状动脉粥样硬化中炎症的激活，尤其是T 细胞起着重要的作用。研究显示在急性心肌梗死中不同的T细胞亚群在动脉粥样硬化的进展中起着不同的作用[9]。在ACS患者中存在Th1细胞的激活和Th1/Th2细胞的失衡，通过调节辅助性T 细胞分泌的细胞因子水平，能够改变斑块内和外周血中T细胞的数目，从而能够稳定ACS患者动脉粥样硬化的斑块[10]。体外研究试验发现诱导产生Treg 细胞可缩小ACS的斑块，而Treg 细胞的疫苗加速了ACS的进程。Foxp3是Treg 细胞分化和细胞因子分泌的关键核转录因子。近期发现Foxp3的表达和CD127（IL-7受体）有负相关的关系，所以检测时在CD4+CD25+的基础上与CD127抗原相联合，可以把人CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）[11]很好地识别出来。该实验经对ACS患者CD4+CD25+T细胞中外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞的百分率进行检测，进行分析和比较，发现ACS组患者入院时，外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著低于对照组，其中STEMI组CD4+CD25+T细胞中患者外周血CD4+CD25+ CD127-Treg细胞的百分率与UA组及NSTEMI组相比显著较低，UA组及NSTEMI组之间比较差异无统计学意义。可能说明了ACS患者体内Treg细胞水平明显下降，且随着Treg细胞水平的下降几乎与病情严重程度一致。该研究者前期研究发现AMI患者入院时外周血中CD4+CD25+T细胞内CD4+CD25+ CD127-Treg细胞的百分率显著低于入院48 h及对照组[12]。提示研究人员也许能够通过检测CD4+CD25+ CD127-Treg细胞的水平，预测ACS的分型及预后，同时对ACS的治疗方向也有一定的指导作用。同时研究人员还发现ACS患者血浆LXA4水平与CD4+CD25+ CD127-Treg细胞百分率呈显著正相关，说明两者均在ACS的发生发展及发病过程中起到了调节作用，但具体的作用机制尚需进一步的研究。
[参考文献]
[1] Chinwong D，Patumanond J，Chinwong S，et al. Clinical indicators for recurrent cardiovascular events in acute coronary syndrome patients treated with statins under routine practice in Thailand： an observational study[J].BMC Cardiovasc Disord，2015 Jun 16；15（1）：55.doi： 10.1186/s12872-015-0052-y.PMID：26076586
[2] Bentzon JF，Otsuka F，Virmani R，et al. Mechanisms of plaque formation and rupture[J].Circ Res，2014，114（12）：1852-1866.
[3] Zhang D， Wang SQ， Guan YQ， et al. Effect of oral atorvastatin on CD4+CD25+ regulatory T cells， FoxP3 expression， and prognosis in patients with ST-segment elevated myocardial infarction before primary percutaneous coronary intervention[J].J Cardiovasc Pharmacol，2011，57（5）：536-541.
[4] Backteman K，Andersson C，Dahlin LG，et al. Lymphocyte subpopulations in lymph nodes and peripheral blood： a comparison between patients with stable angina and acute coronary syndrome[J].PLoS One，2012，7（3）：e32691.doi： 10.1371/journal.pone.0032691. Epub 2012 Mar 1. PMID：22396788.
[5] Chen XQ，Wu SH，Zhou Y，et a1. Lipoxin A4-induced heme oxygenase-1 protects cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury via p38 MAPK activation and Nrf2/ARE complex[J].PLoS One，2013 Jun 24，8（6）：e67120. doi： 10.1371/journal.pone.0067120. Print 2013. PMID：23826208.
[6] Gregoric P， Pavle G， Sijacki A，et a1.SIRS score on admission andinitial concentration of IL-6 as severe acute pancreatitis outcomepredictors[J].Hepato-Gastroenterology，2010，57（98）：349-353.
[7] Zhou MT，Chen BC，Sun HW，et a1. The protective effects of Lipoxin A4 during the early phase of severe acute pancreatitis in rats[J].Scand J Gastroenter，2011，46（2）：211-219.
[8] Serhan CN， Yacoubian S，Yang R. Anti-inflammatory and proresolving lipid mediators[J].Annu Rev Pathol，2008（3）：279-312.
[9] Zhao XW，Bao JJ，Hu C，et al. Effect of diclofenac on the levels of lipoxin A4 and Resolvin D1 and E1 in the post-ERCP pancreatitis[J].Dig Dis Sci，2014，59（12）：2992-2996.doi： 10.1007/s10620-014-3280-6.Epub 2014 Jul 17.PMID：25030943.
[10] Wu HY，Maron R，Tukpah AM，et al.Mucosal anti-CD3 monoclonal antibody attenuates collagen-induced arthritis that is associated with induction of LAP+ regulatory T cells and is enhanced by administration of an emulsome-based Th2-skewing adjuvant[J].J Immunol，2010，185（6）：3401-3407.
[11] Liberal R，Grant CR，Holder BS，et al.In autoimmune hepatitis type 1 or the autoimmune hepatitis-sclerosing cholangitis variant defective regulatory T-cell responsiveness to IL-2 results in low IL-10 production and impaired suppression[J].Hepatology，2015，62（3）.doi：10.1002/hep.27884. PMID：25953611
[12] 柳洪杰，刘鲁滨.急性心肌梗死患者不同时期外周血LXA4与CD4+CD25+CD127-调节性T细胞水平及相关性研究[J].中国医药导报，2015（7）：42-45.
（收稿日期：2015-07-10）
