【摘要】 目的：对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行嗜肺军团菌监测，掌握南京市公共场所中军团菌的污染情况和菌型分布。方法：对12家商场、医院中央空调系统采集水样（冷却水、景观水、淋浴水、自来水），土壤类样品（背景土、花卉土、风管积尘、景观土），采用传统细菌培养法及荧光PCR法进行嗜肺军团菌的分离鉴定。结果：12家单位共采样234份（水样88份、土壤146份），传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1型），检出率为3.85%；而实时荧光PCR法检出47份阳性（主要类型为Lp1型），检出率为20.08%。两者检出阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：南京市公共场所存在嗜肺军团菌污染，荧光PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法，荧光PCR方法较培养法灵敏性较好。
【关键词】 嗜肺军团菌； 荧光PCR法； 公共场所
【Abstract】 Objective： To monitor the Legionella pneumophila of public environmental samples （water， soil， aerosol）， and grasp the pollution situation and strains of Legionella pneumophila in public places in Nanjing city distribution.Method： Samples in water and soils of twelve stores and hospitals were collected， Legionella pneumophila were detected and identified by tradtional culture and real-time PCR. Result： 234 samples were collected（water 88 samples， soil 146 samples） and 9 Legionella pneumophila strains were isolated used culture methods （the main type of Lp1 type）， the detection rates of pneumophila was 3.85%. while 47 samples were tested positive using Real-time PCR（the main type of Lp1 type）. The detection rates of pneumophila were 20.08%. The detection rate of positive comparative difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Legionella pneumophila are existed in public places of Nanjing. Legionella pneumophila detection rate is higher by Real-time PCR than traditional culture， and it is more sensitive than culture methods.
【Key words】 Legionella pneumophila； Real-time PCR； Public places
据美国疾病预防控制中心报道，普通肺炎中约15%由嗜肺军团菌（Lp）感染引起，军团菌肺炎中约85%由Lp1引起。最近的研究表明，在社区获得性肺炎中嗜肺军团菌为第2位的病因。我国福建、浙江、广东、河北、新疆等省市曾有过该病病例报道，卫生部关于2006年生活饮用水和重点公共场所卫生监督检查情况的通报中，对全国1060家宾馆饭店的集中空调通风系统进行检测，其中检测冷却塔1016个，冷却水中军团菌检出率高达24.5%。国际上，多个国家已将军团菌肺炎定为法定传染病之列，WHO也将其列入传染病报告范围[1-2]。
传统的公认的细菌培养法因取材多为痰标本，培养时间少则3～4 d，多则1～2周，不仅费时、费力，而且培养过程中因生长较慢，极易被其他杂菌污染而出现假阴性。荧光PCR因特异、灵敏的特点已成为临床检测军团菌必不可少的方法之一[3-4]。本研究通过对公共场所环境样本（水、土壤、气溶胶）进行军团菌监测调查，掌握南京市公共场所中嗜肺军团菌的污染情况和菌型分布，建立环境水、土壤和气溶胶类型样品中嗜肺军团菌分离鉴定方法，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 军团菌基础培养基（BCYE）、选择培养基培（GVPC）（北京陆桥）、军团菌诊断血清（日本生研）、军团菌、嗜肺军团菌荧光PCR试剂盒（上海之江生物科技有限公司）；核酸（DNA/RNA双提）全自动提取试剂盒（台湾台塑公司）。
1.2 仪器 台式高速冷冻离心机（Eppendorf，Germany），CO2培养箱（NAPCO2IN 5420-1），集菌器（Millpore EZ-Par）。荧光定量PCR仪（ABI，7500 Fast Real-PCR System 16522）全自动核酸提取仪（台湾台塑，MeDiPro SuperPure System-32 D32035）。
1.3 方法
1.3.1 采样数量 对12家商场、医院中央空调系统采集水样88份（包括冷却水、景观水、淋浴水、自来水），土壤类样品146份（包括背景土、花卉土、风管积尘、景观土）；环境采样共计234份，均在2012年8-10月进行。
1.3.2 样品处理 （1）水样本：将500 mL水样无菌操作倒入膜过滤系统中，通过孔径0.45 μm滤膜过滤。取下滤膜置于已加入15 mL无菌蒸馏水和适量灭菌玻璃株的50 mL无菌离心管中，放在振荡器上振荡1 min。（2）土壤样品：对背景土、花卉土、景观土进行洗脱分离，将样品充分均匀，称取5 g，无菌操作倒入预先灭菌并装有适量玻璃珠的锥形瓶中，随后加入45 mL含有0.01%吐温80的0.2M PBS，置振荡器上200～300 r/min，震荡20～30 min，静置15 min；对风管积尘样品进行洗脱分离，将样品充分均匀，称取0.5 g，无菌操作倒入预先灭菌并装有适量玻璃珠的大试管（容量30 mL）中，随后加入4.5 mL含有0.01%吐温80的0.2M PBS，置振荡器上200～300 r/min，震荡2～30 min，静置15 min。
1.3.3 传统培养法 按卫监督发[2006]第58号《公共场所集中空调通风系统卫生规范》进行传统培养。
1.3.4 荧光定量PCR法测定 （1）核酸提取方法：DNA提取采用全自动核酸提取仪，按MeDiPro SuperPure System-32操作步骤说明进行。纯化核酸的析出溶液放入经高温高压灭菌及RNase-free的干净EP管中；嗜肺军团菌荧光PCR试剂盒，依据试剂盒操作说明书进行。（2）荧光定量PCR扩增体系和反应条件：总反应体系为25 µL，包括PCR反应液19.5µL，混合酶液（Tap酶+UNG酶）0.5 µL，模板DNA 5 µL；反应条件为UNG处理（50 ℃ 2 min）1个循环；预变性（95 ℃ 3 min）1个循环，PCR 95 ℃ 5 s，55 ℃ 60 s，40个循环（此阶段结束时采集荧光信号）。（3）荧光定量PCR结果判定：荧光定量PCR检测以Ct值<30，并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；Ct值30～35需要重复实验，2次实验均能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性；Ct值>35或无Ct值为阴性。
1.4 统计学处理 应用PEMS 3.1统计学软件对数据进行处理，计数资料比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义
2 结果
234份（水样88份，土壤146份）样品中，传统细菌培养法检出嗜肺军团菌9份（主要类型为Lp1），检出率为3.85%；而实时荧光定量PCR法检出47份（主要类型为Lp1），检出率为20.08%。荧光定量PCR法总检出率明显高于传统细菌培养法，有较好的灵敏性（P<0.05），见表1。
3 讨论
在我国的大中城市，随着集中空调系统和供水系统的广泛应用，军团菌病的暴发或者流行的危险性也越来越大。国内文献显示我国不同城市的军团菌检出率差别较大，北京市在1998-2006年的公共场所军团菌检出率达14.07%[5]。上海市在2009年医院嗜肺军团菌检出率达到17.1%[6]，广州市2006-2010年公共场所的嗜肺军团菌检出率为15.51%[7]，而我市2012年公共场所的嗜肺军团菌检出率为20.1%（荧光定量PCR 法主要分布在冷却水中），细菌培养法检出率为3.85%且均在水中，土壤中未分离到，表明空调冷却水是本市嗜肺军团菌的主要污染水体。
本次实验采用培养法和荧光PCR法进行嗜肺军团菌检测比较，PCR法检出率（20.08%）远高于培养法（3.85%），差异有统计学意义（P<0.05），表明PCR法更为灵敏。但自1976年军团菌被发现以来，对嗜肺军团菌最为肯定的诊断方法还是分离培养，嗜肺军团菌诊断检测的金标准仍为分离培养。由于嗜肺军团菌培养所需培养基组成成分复杂，需要L半胧氨酸、活性炭、含铁物质等成分、培养时间较长（3～7 d）、需要CO2培养箱，并且由于其他杂菌的过分生长而难以从临床和环境标本中分离出来，故不适用于早期诊断。快速准确地应对由嗜肺军团菌引起的不明原因呼吸道疾病，需要两种方法的有机结合，该方法的建立为我国呼吸道传染病预防控制工作提供技术支持[8]。
本次调查所检出嗜肺军团菌的血清型以Lp1型为主，北京、上海、杭州、武汉等地的嗜肺军团菌调查结果是主要型别为Lp1型，其次为Lp5、Lp6型[9]，相比之下本市嗜肺军团菌型别分布具有地区特异性。同时，笔者在检测水样中还分离出4株非嗜肺军团菌，4株军团菌（未能分型）。后期结果显示，本市采取定期清洁消毒等措施后，嗜肺军团菌控制效果显著。公共交通系统、商场、宾馆人流量较多，因此减少其通风系统的微生物污染是军团病预防控制工作的重点[10-11]。此外，在宾馆、商场、医院的29份冷却水中检出22份阳性（荧光PCR法），检出率为75.9%，提示冷却水中存在发生军团菌病的可能，应引起足够重视。南京为4大火炉城市之一，气候炎热在梅雨季节又闷热潮湿，夏季持续时间较长，公共场所的集中空调使用频率非常高，充足的阳光和高温环境特别适宜军团菌的生长繁殖。监测工作主要集中在每年的8-10月份。据报道广州等地区一年四季嗜肺军团菌的检出率都较高，尤其在夏秋两季，其中8月份的嗜肺军团菌检出率最高，而春季4月份最低[12]。这与军团菌的最适生长温度（36～42 ℃）有关。
本次监测结果提示，嗜肺军团菌的污染与空调系统频繁使用而导致冷却塔水温升高有关，同时也说明本市外环境水体中嗜肺军团菌存在一定程度污染，此外（依据实时荧光PCR法）外环境土壤中也存在一定污染，但培养法未能分离出，分析原因可能是因为土壤成分复杂，菌量过低，并且杂菌的过快生长也干扰正常细菌的分离。市内高楼大厦密集，各空调冷却塔消毒杀菌的时间不统一，军团菌有机会在这些冷却塔之间不断更换宿主，随着空调使用时间的增加，被军团菌污染的冷却塔数量会越来越多[13]。
综上所述，破坏空调冷却塔水中的军团菌微生态环境，是阻断军团菌在空调冷却塔之间的相互传播，防控军团菌的根本措施。
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（收稿日期：2014-03-10）（本文编辑：蔡元元）
