不同龄期果蝇DNA含量的检测与比较

材料[7]。作为经典的模式生物，果蝇被广泛应用到各种研究中。笔者选用8个品系果蝇作为试验材料，通过对8个品系果蝇的5个龄期的DNA含量进行检测与分析，分析不同品系果蝇DNA含量的差异以及同一品系果蝇5个龄期DNA含量的变化，同时进行PCR效果检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取黑果蝇[Drosophila virilis（D）]和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的7个突变品系的5个龄期（Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄、蛹、成虫）作为试验材料，7个突变品系具体见表1。均由辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室长期饲养。

1.2 DNA提取

总DNA的提取采用破碎的方法，1个样品中包含5头果蝇。将浸泡于无水乙醇中的果蝇取出，用1×TE（Tris，EDTA）缓冲液洗涤2次，使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒按照说明书进行总DNA的提取，溶于100 μL buffer TE，并于-20 ℃下保存。

1.3 DNA含量的测定

使用UV-3200PCS紫外分光光度计进行DNA含量的测定。

1.4 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳

使用Agilent Sure Cycle 8800梯度PCR仪对提取DNA进行PCR扩增，采用通用引物[8]：LCO1490（5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）和HCO2198（5’-TAAACTTCAGGGTGACC-AAAAA-ATC-3’）。PCF反应体系（30 μL）：ddH2O 21.25 μL、10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.4 μL、上下游引物各0.6 μL、Taq酶5 U/μL（0.15 μL）、DNA模版2 μL。PCR扩增反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，41个循环；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR扩增产物与6×loading buffer混合均匀，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。使用DYY-6B稳压稳流电泳仪和DYCP-31A琼脂糖电泳槽进行电泳，电泳完成后使用BIO-RAD凝胶电泳成像系统进行观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 各品系果蝇5个龄期DNA含量的比较

由表2可知，8种果蝇DNA含量为0.61～7.08 μg/头，8种果蝇幼虫的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ龄的DNA含量呈现递增的趋势，蛹和成虫的DNA含量则呈下降趋势。

其中，黑果蝇DNA含量为0.92～3.98 μg/头，蛹期最少（0.92 μg/头），Ⅲ龄幼虫的DNA含量最高（3.98 μg/头）。野生型黑腹果蝇的DNA含量为0.08～1.10 μg/头，其中成虫的DNA含量最高，为1.10 μg/头。短刚毛型的DNA含量为1.46～4.02 μg/头，其中Ⅰ龄期与成虫相同，Ⅲ龄期最高（4.02 μg/头）。匙状翅型黑腹果蝇的DNA含量为0.80～2.72 μg/头，其中Ⅲ龄期最高（2.72 μg/头）。白眼型果腹果蝇的DNA含量为0.79～1.33 μg/头，其中含量最高的是Ⅲ龄期为1.33 μg/头。新三隐型黑腹果蝇的DNA含量为0.61～1.50 μg/头，其中蛹的含量最高（1.50 μg/头）。白眼黄身型黑腹果蝇的DNA含量为0.89～1.83 μg/头，其中Ⅲ龄DNA含量最高（1.83 μg/头），成虫的DNA含量最低（0.89 μg/头）。残翅型黑腹果蝇的DNA含量为100～7.08 μg/头，其中蛹的DNA含量最高（7.08 μg/头），成虫的含量最低（1.00 μg/头）。

2.2 8种果蝇5个龄期DNA含量的比较

由表2可知，幼虫Ⅰ龄时DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇的新三隐型、白眼型、野生型、匙状翅型、白眼黄身型、短刚毛型、残翅型、黑果蝇。

幼虫Ⅱ龄时DNA含量从小到大依次黑腹果蝇的野生型、白眼型、新三隐型、白眼黄身型、匙状翅型、短刚毛型、残翅型、黑果蝇。

Ⅲ龄幼虫的DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇野生型、新三隐型、白眼型、白眼黄身型、匙状翅型，黑果蝇，黑腹果蝇短刚毛型、残翅型。

蛹的DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇匙状翅型、野生型、黑果蝇、黑腹果蝇白眼型、新三隐型、白眼黄身型、短刚毛型、残翅型。

成虫DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇白眼黄身型、残翅型、新三隐型、匙状翅型、野生型、白眼型、短刚毛型、黑果蝇。

2.3 8种果蝇提取DNA的PCR效果检测

从图1可以看出，黑果蝇和黑腹果蝇的7个突变型品系的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ龄幼虫、蛹和成虫都获得了清晰的条带，PCR扩增效果均较好，其中成

虫的PCR扩增效果最好。DL2000中500 bp条带最亮，每次用量约为34 ng，其他条带的DNA用量均为17 ng。5头样品共

有100 μL，平均每头样品为20 μL，样品每次上样2 μL。8种果蝇每头Ⅰ龄幼虫的COI含量均大于340 ng，Ⅱ龄幼虫中黑果蝇、黑腹果蝇短刚毛型、白眼型、白眼黄身型和残翅型的COI含量均大于340 ng，新三隐型和匙状翅型的COI含量均为170～340 ng，野生型COI含量则低于170 ng，Ⅲ龄幼虫黑腹果蝇残翅型的COI含量低于170 ng，其余7种的COI含量均高于340 ng，蛹期和成虫的COI含量均大于340 ng。

3 结论

该试验结果表明8种果蝇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ龄幼虫DNA含量递增，幼虫的Ⅲ龄个体最大，大部分蛹和成虫DNA含量递减。成虫的DNA含量并不是果蝇DNA含量的最高时期。黑果蝇的DNA 含量明显高于其他品系。除黑果蝇以外，Ⅲ龄幼虫的DNA含量往往是5个龄期最高的，DNA含量最低的时期最多出现在Ⅰ龄幼虫或成虫。

果蝇5个龄期DNA的PCR扩增效果都很好，其中成虫的PCR扩增效果最好，幼虫次之。幼虫、蛹和成虫都可作为分子鉴定的材料，为物种鉴定提供帮助。

参考文献

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