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㦡"https://www.bjzgcm.com/k/duizhao/" target="_blank" class="keylink">对照检测microRNA-224在癌旁非肿瘤组织及胃癌组织中的表达情况，探讨其阳性表达与胃癌患者临床病理参数、胃癌发生及预后的相关性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
取2004-2006年行胃癌手术并有5年以上完整随访资料的患者病理石蜡切片112例。所做研究均经患者及家属知情同意。其中女32例，男80例，女∶男为1∶2.5；年龄30～82岁，平均59岁。生存期计算：（1）自手术日期至随访截止日期；（2）自手术日期至因肿瘤死亡的日期。胃癌TNM病理分期：参照2010年第七版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）标准[7]。对照组：同期距胃癌肿瘤边缘5 cm以上非肿瘤胃黏膜50例。
1.2 试剂
Hsa-microRNA-224（38501-05，Exiqon，美国）；MK1030敏感性加强型原位杂交检测试剂盒（武汉博士德）；即用型DAB显色液：（SP-9000，北京中杉生物制品有限公司）。
1.3 方法
术后胃癌组织标本予10%中性福尔马林固定后，梯度酒精脱水，常规予石蜡包埋，并连续4 μm切片再次确认。采用MK1030敏感性加强型原位杂交检测试剂盒检测，80 ℃恒温烤片过夜，其后予常规脱蜡至水，1∶300稀释hsa-microRNA-224探针后予原位杂交。严格按原位杂交试剂盒说明书进行实验。其后予组织切片脱水、透明、封片。并予PBS代替一抗做空白对照。
1.4 判定标准
原位杂交结果判定microRNA-224阳性信号：胞浆出现棕黄色。双盲法评定实验结果：两名资深的病理专家根据染色程度及染色细胞所占百分比分别评定和分析。评分标准如下，（1）切片着色程度判定：不着色0分，着色淡1分，着色适中2分，着色深3分；（2）面积判定：着色细胞的百分比≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分；≥51% 3分；（3）乘积判定：染色程度和染色细胞百分比得分相乘0～1分为（-），2～3分为（+），4～6分为（++），>6分为（+++）；（4）结果判定：（-）及（+）为阴性表达，（++）及（+++）为阳性表达[8]。
1.5 统计学处理
采用SPSS 18.0对所得数据进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2或Fisher确切概率检验，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，Kaplan-Meier行生存分析，独立预后因素分析采用COX风险模型进行，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 microRNA-224在非肿瘤胃黏膜组织及胃癌组织切片中表达情况
microRNA-224的表达部位主要是在胃癌组织的胞浆（图1）。50例非肿瘤胃黏膜组织microRNA-224阴性表达。112例胃癌组织中55例（49.1%）阳性表达，57例（50.9%）阴性表达。
（SP法×200倍）
注：图A：microRNA-224在非肿瘤胃黏膜组织中的表达（-）；图B：microRNA-224在中分化腺癌中的表达（+++）
2.2 胃癌患者肿瘤组织中microRNA-224的表达与临床病理特征的关系
microRNA-224的阳性表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度存在相关性（P<0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的部位、分化程度、Lauren分型无关（P>0.05）。胃癌组织中microRNA-224的阳性表达在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴结转移、T3～4期和有远处转移的表达明显高于TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、无淋巴结转移、T1～2期和无远处转移的患者，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.3 胃癌患者肿瘤组织microRNA-224的表达与预后的相关性
Kaplan-Meier生存分析示：胃癌患者microRNA-224在肿瘤组织中阳性表达与其5年生存率存在相关性。其阴性表达与阳性表达相比5年生存率分别为60.0%、21.1%，差异有统计学意义（字2=20.673，P<0.001）（图2）。建立COX回归模型，对可能影响胃癌预后的危险因素：性别、年龄、分化程度、肿瘤大小及部位、Lauren分型、淋巴结转移、远处转移、浸润深度、TNM分期和microRNA-224表达行COX多因素方差分析，结果显示microRNA-224的阳性表达及远处转移是影响胃癌患者预后的独立因素，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
微小RNA（microRNAs）长度约为22个核苷酸，是一类非内源性的非编码小分子RNA。其中约60%位于基因的内含子区域，仅有少数microRNAs位于蛋白的编码区。成熟的microRNAs能够形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silenced complex，RISC），当靶mRNA的3′末端与其完全互补或接近完全的互补时，它能够通过RISC进而触发mRNA的降解；当它们之间不能够互补配对时，则能够通过调控核糖体阻断mRNA的翻译过程，从而能够控制一系列的生物过程，其中包括细胞的增殖，细胞凋亡和细胞分化[9]。也是由于这个原因，microRNAs能够通过调节下游编码蛋白的靶mRNA表达起到致癌或抗癌的作用。
在microRNAs与胃癌的相关性方面近年也做了大量研究，研究发现microRNAs具有较高的组织特异性。在胃癌患者肿瘤发生发展中，既有致癌性的microRNAs（如microRNA-106b-93-25、microRNAs-21、microRNAs-10b、microRNAs-17等）[6]，也有抑癌性的microRNAs（如microRNA-101c、microRNA-101、microRNAs-451、microRNA-149等）[9]。这提示在胃癌早期诊断和判断预后方面microRNAs可能是一种非常有效的肿瘤相关标志物，并有可能成为肿瘤发展过程中的筛查手段、治疗靶点及判断预后的依据。
microRNA-224作为其中一员也成为研究热点，文献[10-12]称其在人类多种肿瘤组织中阳性表达，并参与肿瘤形成和发展的调节过程。Ueda等[7]曾报道称microRNA-224在胃癌组织中阳性表达。但是未有其在胃肿瘤组织中的表达与临床病理特征之间关系及对患者预后影响的报道。
本研究显示，microRNA-224在非肿瘤胃黏膜组织中的表达均为阴性。而胃癌患者肿瘤组织之中主要表达于肿瘤组织的胞浆内，其阳性率为49.1%（55/112），且阳性表达情况与浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移存在相关性，差异均有统计学意义（P<0.05），其关系仍需进一步研究；而与患病年龄、肿瘤的部位、大小、分化程度等无相关性（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析亦显示，胃癌患者肿瘤组织中阳性表达者相对于阴性表达者总体5年生存率明显降低，差异有统计学意义（P<0.001），其阳性表达影响患者生存。进一步行COX多因素分析显示microRNA-224的阳性表达是胃癌的独立预后因素之一。这些结果表明microRNA-224可能在促进胃癌患者肿瘤的发生、发展、肿瘤浸润和转移等方面发挥了重要的作用，其阳性表达预示预后不良。此外microRNA-224在胃癌的较早阶段亦有统计学差异，也许可以作为早期诊断的标记物。microRNA-224在胃中的调控机制尚未清楚，但目前Mees等[10]研究发现microRNA-224在胰腺导管肿瘤中，能够通过调控CD40的表达进而在胰腺导管癌中发挥着作用；Gokhale等[11]研究发现其通过WNT通路在成神经管细胞瘤中起到调控的作用；Li等[13]的研究表明microRNA-224在HepG2细胞内通过调控PAK4以及MMP9表达进而起到促进肿瘤细胞扩增、侵袭及迁移的作用；而在卵巢癌的发生发展中通过调控KLK蛋白表达，起到调控卵巢肿瘤细胞增殖的作用[12]。也许在胃癌的发生发展中也有同样的分子机制、通路及作用蛋白靶点的存在，需要进一步的研究。
总之，microRNA-224在胃癌患者肿瘤组织中的表达与肿瘤TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移存在相关性，其阳性表达患者的5年生存率低，提示其阳性表达与胃癌患者预后相关，并是影响胃癌患者的预后独立因素之一。但胃癌的发生、发展、浸润、转移是多种基因及机制共同作用的结果[14-16]，仍需要进一步的探索。
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（收稿日期：2016-05-12）
